副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测技术_老木一支笔专业编制可行性研究分析报告_资金项目立项申请报告

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副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测技术

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1　范围
本标准规定了副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测技术的要求。
本标准适用于猪血液、组织及细菌培养物中副猪嗜血杆菌的检测。
2　规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法
3　术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1　
Ct值　Cycle threshold
每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。
4　缩略语
下列缩略语适用于本文件。
HPS：副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）
5　仪器与试剂
除非另有说明，在检测中使用的化学试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T 6682的要求。
5.1　微量可调移液器（最大量程为10 μL、20 μL、100 μL、1000 μL）。
5.2　高速冷冻离心机。
5.3　荧光定量PCR仪。
5.4　水浴锅。
5.5　恒温培养箱。
5.6　-20 ℃冰箱。
5.7　二级生物安全柜。
5.8　超低温冰箱：可控温至-70 ℃。
5.9　10 mL抗凝采血管。
5.10　一次性无菌5 mL注射器。
5.11　1.5 mL无RNA酶离心管。
5.12　0.2 mL PCR薄壁管或八联管。
5.13　PBS缓冲液。
5.14　SYBR Green Ⅰ核酸染料（含酶）。
5.15　蛋白酶K（见附录A.1）。
5.16　10%SDS液（见附录A.2）。
5.17　70%乙醇（见附录A.3）。
5.18　引物：P1：5'-ACCAGAAGCAAACCCAGAGC-3'，P2：5'-ACACCGCTTGCCATACCCTC-3'。
5.19　标准阳性对照：HPS infB基因阳性质粒。
5.20　标准阴性对照：无菌超纯水。
6　方法
6.1　样品采集
6.1.1　活体采样：无菌采集抗凝血。
6.1.2　病死猪采样：无菌采集心包积液或胸腔积液或肺脏组织。
6.1.3　细菌培养物：37 ℃培养24 h～48 h的细菌培养物。
6.2　样品处理
6.2.1　组织样品处理：取肺脏组织3 g～5 g于研钵中，用灭菌剪刀剪碎，加入2 mL PBS缓冲液，研磨。
6.2.2　细菌培养物处理：挑取3～4个细菌单菌落加入100 μL灭菌水中，煮沸10 min后，再放置-20 ℃冻结。冻融后，10000 r/min离心5 min，取上清作为DNA模板，-20 ℃保存备用。
6.3　核酸提取
6.3.1　取样品500 μL于1.5 mL离心管中，加入50 μg/mL的蛋白酶K 5 μL，加入10 %的SDS溶液25 μL，55 ℃水浴2 h～3 h。
6.3.2　加入200 μL Tris饱和酚，充分混匀，10000 r/min离心15 min。
6.3.3　取上清于一新的离心管中，加入200 μL Tris饱和酚和200 μL 氯仿，10000 r/min离心15 min。
6.3.4　取上清于一新离心管中，加入200 μL 氯仿，10000 r/min离心15 min。
6.3.5　取上清于一新离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，-20 ℃静止20 min，10000 r/min离心15 min，弃上清。
6.3.6　加入70 %的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。
6.3.7　加入100 μL灭菌超纯水溶解沉淀，-20 ℃保存备用。
6.4　荧光定量PCR反应体系
荧光定量PCR反应体系，详见附录B.1。
6.5　荧光定量PCR程序设定
每次PCR均应设阳性对照与阴性对照，具体参数见附录B.2。
7　结果判定
7.1　试验成立条件
7.1.1　阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。
7.1.2　阳性对照Ct值＜30，并出现特定扩增曲线，否则，此试验视为无效。
7.2　判定
7.2.1　阴性
Ct值＞35，表明样品为阴性。
7.2.2　阳性
Ct值＜30，且出现特定扩增曲线，表明样品中存在HPS。
7.2.3　疑似
30≤Ct值≤35的样品须重检，结果仍然在该区间，判定为阳性。
A
A
附　录　A
（资料性附录）
试剂的配制
A.1　蛋白酶K溶液(20 mg/mL)
蛋白酶K              100 mg
灭菌双蒸水           5 mL
A.2　10 %十二烷基硫酸钠（SDS溶液，pH7.2）
十二烷基硫酸钠       10 g
灭菌双蒸水           80 mL
浓盐酸               调pH至7.2
灭菌双蒸水           加至100 mL
A.3　70 %乙醇
无水乙醇             70 mL
灭菌双蒸水           30 mL
B
B
附　录　B
（规范性附录）
荧光定量PCR反应体系和程序
B.1　荧光定量PCR反应体系
表B.1　荧光定量PCR反应体系
组分反应体系
SYBR Green Ⅰ核酸染料 12.5 μL
引物P1 1.0 μL
引物P2 1.0 μL
DNA模板 2.0 μL
灭菌水 8.5 μL
总量 25.0 μL
B.2　荧光定量PCR反应程序
表B.2　荧光定量PCR反应程序设定
温度时间
步骤1 95 ℃ 10 min
步骤2（40个循环） 95 ℃ 10 s
58 ℃收集信号 10 s
步骤3 95 ℃ 2 min
60 ℃ 20 s
95 ℃ Continue

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