1　范围
本规范规定了禽波氏杆菌凝集试验和间接ELISA抗体检测技术的术语和定义、试剂或材料、仪器设备，利用平板凝集试验、试管凝集试验和间接酶联免疫吸附实验（iELISA）检测禽波氏杆菌抗体的方法和技术要求。
本规范适用于禽场禽波氏杆菌的流行病学调查、诊断和疫情监测。
2　规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 603　化学试剂　试验方法中所用制剂及制品的制备
GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法
GB 14925　实验动物　环境及设施
3　术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1　
禽波氏杆菌　Bordetella avium, B. avium
是波氏杆菌属（The genus Bordetella）四个种中的一个新种，1984年由Kersters确认。
3.2　
试管凝集试验　tube agglutination test
常用已知已定量的抗原与一系列稀释的禽的血清混合，在保温放置后观察结果，以判定受检血清有无相应抗体及其效价。多用于半定量和定量试验。
3.3　
间接酶联免疫吸附实验　indirect enzyme-linked immunosorbent assay, iELISA
ELISA是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。iELISA是基于ELISA反应原理设计的，包被抗原后加入待测抗体，反应后洗板，加入酶标二抗，反应后再洗板，加入底物显色。
4　试剂或材料
4.1　禽波氏杆菌标准株
禽波氏杆菌P5株，购自中国兽医药品监察所。
4.2　禽波氏杆菌阳性血清
SPF鸡经免疫禽波氏杆菌抗原三次后获得的血清，每次免疫间隔两周。
4.3　阴性血清
从SPF鸡分离的血清。
4.4　待检禽血清
采集禽的血液，于37 ℃温箱中静置2 h，收集析出的血清。
4.5　生化试剂
灭菌0.5 %石炭酸生理盐水、PBS、PBST、Tris-HCl、牛血清白蛋白（BSA）、底物反应液（具体配制方法见附录A）。
5　仪器设备
5.1　平板（玻板、白瓷板或载玻片）。
5.2　微量移液器：量程为20 μL～100 μL。
5.3　接种环。
5.4　试管架。
5.5　小试管（口径8 mm～10 mm）。
5.6　灭菌吸管（1 mL）。
5.7　恒温培养箱。
5.8　匀速振荡器。
5.9　96孔ELISA酶标板。
5.10　酶标仪（波长范围340 nm～850 nm）。
6　禽波氏杆菌抗体检测平板凝集试验
6.1　用20 μL微量移液器分别吸取三滴禽波氏杆菌P5株标准抗原于平板上。
6.2　再分别取禽波氏杆菌阳性抗体、阴性血清和待检禽血清各一滴加入上述抗原液中，并用接种环混合均匀，3 min～5 min观察结果。
6.3　平板凝集试验可参考图1：
 
图1　平板凝集试验图示
6.4　结果判定：
6.4.1 阳性血清与阳性抗原作用后出现明显凝集颗粒，阴性血清与阳性抗原作用后仍均匀混浊，试验结果有效。
6.4.2 待检禽血清与阳性抗原作用后出现明显凝集颗粒，则判为阳性。
6.4.3 待检禽血清与阳性抗原作用后均匀混浊，则判为阴性。
6.4.4 待检禽血清与阳性抗原作用后介于阴阳性之间，判为可疑。
7　禽波氏杆菌抗体检测试管凝集试验
7.1　被检禽血清稀释度设定
通常情况下，用1:25、1:50、1:100、1:200四个稀释度；大规模检疫时，可只用前两个稀释度。
7.2　血清的稀释及抗原的加入
7.2.1　血清的稀释
7.2.1.1　为每份血清准备小试管5支，第一管加入2.3 mL石炭酸生理盐水，第二管不加，第三、四、五管各加入0.5 mL石炭酸生理盐水。
7.2.1.2　用1 mL吸管吸取被检血清0.2 mL，加入第一管中，并混合均匀，然后用吸管吸取混合液0.5 mL，加入到第二管中，混合均匀，再吸取混合液0.5 mL加入到第三管，同样混匀，从中吸取0.5 mL加入第四管混匀，再从第四管吸取0.5 mL加入第五管，第五管混匀后弃去0.5 mL。这样稀释之后，从第二管到第五管，血清稀释度分别为1:12.5、1:25、1:50、1:100。
7.2.2　加入抗原
先用含0.5 %石炭酸生理盐水，将抗原原液作20倍稀释，然后从第二管起每管加入抗原稀释液0.5 mL（第一管不加，作血清蛋白凝固对照），振荡均匀。加入抗原后，第二至第五管各管混合液的容积均为1 mL，血清稀释度依次变为1:25、1:50、1:100、1:200。
7.2.3　对照管的制作
每次试验均须作阳性血清（Ab+）对照、阴性血清（Ab-）对照、抗原（Ag+）对照。
试管凝集试验操作过程可参考表1：
表1　试管凝集试验方法
试　管　号 1　　 2　　 3　　   4　　  5　    6　　 　 7        8
血清终稀释度 1:12.5 　1:25    1:50    1:100    1:200   Ag+ 对照  Ab+对照  Ab- 对照
0.5%石炭酸生理盐水 2.3            0.5     0.5      0.5       0.5        －　　　  －
0.2     0.5     0.5     0.5      0.5       －      0.5(Ab+)   0.5(Ab-)
                              
舍去0.5
待检血清 
阳性抗原（1:20） 　0.5     0.5     0.5     0.5      0.5       0.5        0.5       0.5

7.2.4　凝集反应
全部试管于匀速振荡器充分振荡后置于37 ℃～38 ℃温箱中22 h～24 h，然后检查并记录结果。
7.3　结果判定
7.3.1　判定依据
根据各管中上清液的透明度、抗原被凝集的程度及凝集块的形状，来判定凝集反应的程度。
7.3.2　凝集程度判定标准
100 %抗原凝集（++++）：抗原全部凝集，呈伞状沉于管底，上清液完全清亮透明；
75 %抗原凝集（+++）：约有3/4的抗原被凝集，管底凝集物与++++相同，只是上清液稍混浊；
50 %抗原凝集（++）：约1/2的抗原被凝集，管底有中等量的凝集物，上清液混浊半透明；
25 %抗原凝集（+）：约1/4的抗原被凝集，管底有少量凝集物，上清液完全混浊不透明；
0 %抗原凝集（-）：抗原完全未凝集，上清液完全混浊不透明，但由于菌体抗原自然下沉，在管底中央出现规则的菌体自沉圆点。
试管底部凝集程度判定可参考图2：
 
图2　试管底部凝集现象图示
7.3.3　凝集价判定
能使50 %抗原凝集的血清最高稀释度称为该血清凝集价（或称滴度）。
7.3.4　待检血清样本结果判定标准
血清凝集价大于或等于1:50，判为阳性；血清凝集价为1:25，判为疑似反应。疑似反应者，3周后须重新采血，再次进行试验，如果仍为疑似反应时，可判为阳性。
8　禽波氏杆菌间接酶联免疫吸附实验（iELISA）抗体检测方法
8.1　禽波氏杆菌外膜蛋白（OMP）的提取
8.1.1　将保存的禽波氏杆菌株接种于200 mL肉汤培养基中，37 ℃振荡培养过夜后，离心收集过夜培养的细菌。
8.1.2　用10倍体积的含有10 mM MgCl2的Tris-HCl（100 mM pH7.8）缓冲液悬浮，超声波破碎（功率为500 W、破碎时间60 s、间隙60 s、反复破碎10次）。
8.1.3　通过1000×g低速离心去除细胞核，上清液高速离心，10000×g，20 min。
8.1.4　含全膜蛋白的沉淀，用同体积的含2 % Triton X-100的Tris-MgCl2缓冲液溶解，室温下孵育30 min降解内膜蛋白后，再进行100000×g，30 min超速离心。
8.1.5　沉淀用缓冲液再悬浮，置-20 ℃保存备用。
8.2　禽波氏杆菌外膜蛋白（OMP）抗血清的制备
8.2.1　将提取的禽波氏杆菌OMP蛋白液与弗氏不完全佐剂混合（V:V=1:1），用漩涡振荡器乳化，制备禽波氏杆菌OMP免疫用抗原。.
8.2.2　选取体重1 kg以上的健康鸡4只，肌肉注射免疫OMP抗原，共免疫4次，每次间隔1周，OMP免疫剂量为320 μg/只/次。实验鸡的饲养符合GB 14925的要求。
8.2.3　最后1次免疫后7 d采血，用上述试管凝集试验检测血清中鸡抗禽波氏杆菌抗体的凝集价，凝集价高于1:256以上时采血，分离血清，-20 ℃保存备用。
8.3　阴性血清制备
采集SPF鸡的血液，制备阴性血清。
8.4　间接酶联免疫吸附实验（iELISA）检测方法
8.4.1　包被
将禽波氏杆菌OMP用包被液（0.05 mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6）稀释成10 μg/mL，包被酶标板。
8.4.2　封闭
用PBST洗涤酶标板5次。每孔加入封闭液（含1 ℅BSA的PBS）200 μL，置湿盒内，4 ℃封闭过夜。
8.4.3　加一抗
用PBST洗涤酶标板5次。取1孔加入1:10倍稀释鸡抗禽波氏杆菌高免血清（作阳性对照），取1孔加入1:10倍稀释的鸡阴性血清（作阴性对照）；其它孔加1:10稀释的待检血清，置湿盒内37 ℃作用60 min。抗体稀释液为1 ℅BSA的PBS。
8.4.4　加二抗
用PBST洗涤酶标板5次。加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗鸡IgG（抗体稀释液为1 ℅BSA的PBS），置湿盒内37 ℃作用45 min。
8.4.5　底物显色
用PBST洗涤酶标板5次。加底物反应液，置湿盒内37℃避光显色20 min。
8.4.6　读数
用2 mol/L的H2SO4溶液终止反应，用酶标仪检测反应孔的OD490值。
8.4.7　结果判定
以待测孔的OD值大于或等于阴性对照孔的2倍者，即P/N大于或等于2判为阳性，重复3次计算平均值。
A
A 
附　录　A
（资料性附录）
溶液的配置
A.1　试管凝集试验中灭菌0.5%石炭酸生理盐水的配制
称取9 g氯化钠（NaCl）溶于水，定容到1 L，再加入5 mL苯酚。配制后高压灭菌器灭菌后使用。
A.2　禽波氏杆菌间接酶联免疫吸附实验中相关试剂的配制
A.2.1磷酸盐缓冲液（PBS）的配制
1 mol/L PBS（pH 7.2）的配方：
氯化钠（NaCl）          8.0 g
氯化钾（KCL）           0.2 g
磷酸氢二钠（Na2HPO4）    1.44 g
磷酸二氢钾（KH2PO4）     0.24 g
双蒸水（H2O）            定容至1000 mL
A.2.2 PBST缓冲液的配制
 1 L PBS + 1 mL Tween-20
A.2.3 牛血清白蛋白（BSA）
将100 mg的牛血清白蛋白加入9.5 mL水中（须将蛋白加入水中，而不是将水加入蛋白中），盖好盖后，轻轻摇动，直至牛血清白蛋白完全溶解为止。加水定容到10 mL，然后分装成小份，贮存于-20 ℃。
A.2.4 Tris-Hcl缓冲液的配制
Tris 碱                  121.1 g
浓盐酸（1mol/L HCl）     42.0 mL
双蒸水                   定容至1000 mL
在900 mL双蒸水中加入121.1 g Tris 碱，溶液冷却至室温后调节溶液pH值至8.0，然后定容至1000 mL，分装后1.034×105高压灭菌30 min，室温保存。
A.2.5 底物反应液的配制
取10 mL磷酸盐－柠檬酸缓冲液，加邻苯二胺（OPD）4 mg和3 % H2O2 15 μL。

实验室用水应符合GB/T 6682的要求。试验中配制试剂应符合GB/T 603的要求。