猪伪狂犬病毒环介导等温扩增检测技术_老木一支笔专业编制可行性研究分析报告_资金项目立项申请报告

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猪伪狂犬病毒环介导等温扩增检测技术

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1　范围
本标准规定了猪伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus，PRV）的环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）检测技术的操作步骤。
本标准适用于猪伪狂犬病毒的检测。
2　规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3　术语与定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1　
LAMP
环介导等温扩增技术。
3.2　
Bst DNA Polymerase
嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶。
3.3　
SDS
十二烷基硫酸钠。
3.4　
4S Green Plus Nucleic Acid Stain
无毒型核酸染色剂。
4　材料及设备
4.1　主要仪器设备
4.1.1　微量移液器（最大量程分别为10 μL、20 μL、100 μL、1000 μL），带滤芯的枪头。
4.1.2　20000 r/min低温高速离心机。
4.1.3　电热恒温水槽。
4.1.4　稳流稳压电泳仪。
4.1.5　水平电泳槽。
4.1.6　凝胶成像系统。
4.1.7　紫外透射反射分析仪。
4.1.8　电磁炉。
4.1.9　烧杯（1000mL）。
4.1.10　电子天平精度为：0.001g。
4.2　主要试剂或材料
4.2.1　5mol/L Betaine溶液：配制见附录A.1。
4.2.2　Bst DNA Polymerase（8U/μL）。
4.2.3　SYBR Green Ⅰ核酸染料。
4.2.4　0.5×TBE缓冲液：配制见附录A.2。
4.2.5　2%琼脂糖电泳液：配制见附录A.3。
4.2.6　4S Green Plus Nucleic Acid Stain。
4.2.7　DNA Marker 2000。
4.2.8　10%SDS溶液：配制见附录A.4。
4.2.9　超纯水：符合GB/T 6682，三级。
4.2.10　引物
猪伪狂犬病毒LAMP检测引物：
F3： 5’- ACGAGCCCCGCTTCCA -3’。
B3： 5’- AGATGCAGGGCTCGTACA -3’。
FIP：5’- AGACCACGCGCGCGGCATCAG-CTTCCACTCGCAGCTCTTCT-3’。
BIP：5’- GAGAACTTCACCGCCACGCT-CGTAGTACAGCAGGCACCG-3’。
5　检测步骤
5.1　样品采集与处理
采集血清或淋巴结、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏等脏器。
5.2　样品处理
5.2.1　血清直接用于DNA提取。
5.2.2　淋巴结、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏等脏器各1 g剪碎放于灭菌的研磨器中磨碎，用生理盐水1∶5倍稀释，取悬液反复冻融3次，5000 r/min离心15 min，取上清液-20 ℃保存备用。
5.3　病毒DNA的提取
5.3.1　取上清液（或血清）500 μL加入10%SDS溶液50 μL、20 mg/mL蛋白酶K溶液10 μL，于55 ℃水浴2 h～3 h。
5.3.2　加入200 μL Tris饱和酚，混匀，4 ℃ 12000 r/min离心15 min。
5.3.3　取上清液500 μL，加入200 μL Tris饱和酚和200 μL三氯甲烷，4 ℃ 12000 r/min离心15 min。
5.3.4　取上清液400 μL，加入200 μL三氯甲烷，4 ℃ 12000 r/min离心15 min。
5.3.5　取上清液300 μL，加入2倍体积的无水乙醇，-20 ℃静置20 min，4 ℃ 12000 r/min离心15 min。
5.3.6　弃上清液，加入1 mL 70 %的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。
5.3.7　加入20 μL灭菌超纯水溶解沉淀，-20 ℃保存备用。
5.4　环介导等温扩增（LAMP）检测步骤
5.4.1　环介导等温扩增反应体系配制，按表1中1～8的循序配制。
表1　环介导等温扩增反应体系（25 μL）
体系组成体系含量
1 10×ThermoPol 2.5 μL
2 dNTP混合液(10 mmol/L) 4.0 μL
3 B3/F3(5 μmol/L) 0.15 μL×2
4 BIP/FIP(50 μmol/L) 1.5 μL×2
5 Betaine(5 mol/L) 3.0 μL
6 DNA 1.0 μL
7 Bst DNA Polymerase(8 U/μL) 1 μL
8 超纯水 10.2 μL
5.4.2　LAMP程序设定
每次LAMP均应设一个阳性对照和阴性对照，具体参数见表2
表2　LAMP反应程序设定
温度时间
1 63 ℃ 60 min
2 80 ℃ 5 min
5.5　电泳
5.5.1　2%琼脂糖凝胶板的制备（见附录A.3）。
5.5.2　加样
将LAMP扩增产物5 μL与1 μL 6×Loading Buffer混合，点样于1%琼脂糖凝胶孔中，以DNA Marker2000作相对分子质量指示。每次电泳加阳性对照和阴性对照的扩增产物作对照。
5.5.3　电泳
保持稳定电压80 V，电泳20 min，观察结果。
6　结果判定
6.1　电泳结果判定
电泳反应结束后，如果阳性对照孔出现瀑布样条带，阴性对照孔不出现瀑布样条带，则试验成立。
在试验成立条件下，出现瀑布样条带泳道的样品判为阳性（说明样品中含有猪伪狂犬病毒），不出现瀑布样条带泳道的样品为阴性（参见附录A.5）。
6.2　可视化结果判定
6.2.1　LAMP反应体系中加入1 μL SYBR Green Ⅰ核酸染料，混匀（加深观察颜色），阳性反应管内液体变为黄色，阴性反应管不发生颜色变化，为橘红色（参见附录A.6）。
6.2.2　反应管置于紫外透射反射分析仪下，阳性反应管发出明亮的黄绿色荧光，阴性反应管不显现荧光（参见附录A.7）。

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