猪圆环病毒2型抗体胶体金快速检测技术_老木一支笔专业编制可行性研究分析报告_资金项目立项申请报告

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猪圆环病毒2型抗体胶体金快速检测技术

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1　范围
本标准规定了猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus Type 2，PCV2）的抗体胶体金试纸条制备方法及试纸条使用规范。
本标准适用于猪圆环病毒2型的抗体快速检测。
2　规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3　术语与定义
下列术语与定义适用于本标准。
3.1　
PVC板
聚氯乙烯板。
3.2　
BSA
牛血清白蛋白。
3.3　
NC膜
硝酸纤维素膜。
3.4　
PBS
磷酸缓冲盐溶液。
4　材料及设备
4.1　主要仪器设备
4.1.1　微量移液器（最大量程分别为10 μL、20 μL、100 μL、1000 μL）。
4.1.2　20000 r/min低温高速离心机。
4.1.3　喷膜仪。
4.1.4　切条机。
4.1.5　PVC板。
4.1.6　0.22μm无菌过滤器。
4.1.7　紫外分光光度计。
4.1.8　电子天平精度为：0.001 g。
4.2　主要试剂或材料
4.2.1　BSA：配制见附录A.1。
4.2.2　氯金酸：配制见附录A.2。
4.2.3　NC膜。
4.2.4　玻璃纤维膜。
4.2.5　吸水纸。
4.2.6　碳酸钾分析纯。
4.2.7　猪圆环病毒2型Cap蛋白。
4.2.8　羊抗兔IgG。
4.2.9　1×PBS溶液(pH值7.4)：配制见附录A.3。
4.2.10　超纯水：符合GB/T 6682，三级。
4.2.11　0.1mol/L Tris-HCL：配制见附录A.4。
4.2.12　Tween-20分析纯。
4.2.13　聚酯纤维膜。
5　免疫胶体金试纸条的制备
5.1　胶体金的制备
所有试剂均需提前经0.22 μm无菌滤器滤过。
5.1.1　用电炉加热99 mL超纯水至沸。
5.1.2　加入1 mL 1 %氯金酸溶液，继续加热3 min。
5.1.3　再缓慢加入2 mL 1 %柠檬酸钠溶液，边加入边用磁力搅拌器进行搅拌。
5.1.4　继续加热，颜色由灰色变为黑色，继而变为亮红色停止加热（约5 min）。
5.1.5　避光室温冷却后，用超纯水补足至100 mL。
5.1.6　用紫外分光光度计分别测其在520 nm和535 nm处的吸光度值，使其吸光度值在0.8～1.0之间即可。
5.2　胶体金标记抗原和标记pH值
用0.2 mol/L碳酸钾将胶体金溶液调节pH值为8.0后，加入纯化后的猪圆环病毒Cap蛋白，使其终浓度为10 μg/mL。
5.3　金标抗原的封闭和纯化
5.3.1　在金标溶液中加入羊抗兔（IgG），使其终浓度为1 mg/mL。
5.3.2　加入1/10体积的10 % BSA溶液（终浓度1%为封闭液）封闭，混匀并静置15 min。
5.3.3　4 ℃，8000 r/min离心20 min弃上清。
5.3.4　用原体积1/20且含有10 %蔗糖的0.1 mol/L Tris-HCL(pH值8.5)储存液重新悬浮沉淀。
5.4　玻璃纤维膜、聚酯纤维膜与NC膜的预处理
5.4.1　聚酯纤维膜（金标结合垫）用Tween-20，37 ℃浸泡30 min。
5.4.2　玻璃纤维膜（样品垫）、NC膜用封闭液37 ℃浸泡30 min。
5.4.3　用1×PBS溶液(pH值7.4) 分别对金标结合垫、样品垫和NC膜洗3次，37 ℃干燥备用。
5.5　喷膜
5.5.1　用喷膜仪将标记Cap蛋白的胶体金以5 μL/cm的喷涂量喷涂到金标结合垫上，37 ℃干燥备用。
5.5.2　将纯化后的猪圆环病毒2型Cap蛋白稀释到1 mg/mL，用喷膜仪按1 μL /cm的喷涂量喷涂到NC膜的检测线（T-线）上，37 ℃干燥备用。
5.5.3　将羊抗兔（IgG）稀释到1 mg/mL，用喷膜仪按1 μL /cm的喷涂量喷涂到NC膜的对照线（C-线）上，37 ℃干燥备用。
5.6　免疫胶体金试纸条的组装
5.6.1　将处理好的样品垫、胶体金结合垫、NC膜和吸水纸（吸水垫）从上到下粘贴在预先裁好的PVC胶板上。
5.6.2　用切条机裁剪制作试纸条，宽度为6 mm，组装胶体金检测卡备用。
6　免疫胶体金试纸条的检测
将检测卡平放在桌面上，将待检血清样品3 滴～4 滴（约80 μL）加入加样孔（S）内，在室温内静置15 min后，5 min之内判断结果。
7　结果和判定
7.1　对照线（C）出现一条紫红色线，试验成立。
7.2　试验成立条件下，判定结果：
a) 检测线（T）处不出现红色线，则待检血清为猪圆环病毒2型抗体阴性；
b) 检测线（T）处出现一条颜色很浅的紫红色线，则待检血清为猪圆环病毒2型抗体弱阳性；
c) 检测线（T）出现一条颜色较深的紫红色线，则待检血清为猪圆环病毒2型抗体阳性。

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