猪伪狂犬病病毒gE基因PCR检测技术_老木一支笔专业编制可行性研究分析报告_资金项目立项申请报告

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猪伪狂犬病病毒gE基因PCR检测技术

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1　范围
本标准规定了猪伪狂犬病病毒（PRV）gE基因PCR检测技术的操作要求。
本标准适用于PRV的实验室诊断、监测和流行病学调查等。
2　实验室生物安全要求
实验室必须为生物安全Ⅱ级（BSL-2级）及以上实验室。
3　规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法。
GB 19489 实验室生物安全通用要求。
GB/T 27401 实验室质量控制规范动物检疫。
4　术语与定义
下列术语与定义适用于本标准。
4.1　
PCR
聚合酶链式反应。
4.2　
SDS
十二烷基硫酸钠。
5　仪器设备和试剂
5.1　仪器设备
5.1.1　微量移液器（最大量程分别为10 μL、20 μL、100 μL、1000 μL），带滤芯的枪头。
5.1.2　20000 r/min低温高速离心机。
5.1.3　电热恒温水槽。
5.1.4　稳流稳压电泳仪。
5.1.5　水平电泳槽。
5.1.6　凝胶成像系统。
5.1.7　紫外透射反射分析仪。
5.1.8　电磁炉。
5.1.9　烧杯（1000 mL）。
5.1.10　电子天平精度为：0.001 g。
5.1.11　PCR扩增仪。
5.1.12　组织匀浆器或研钵。
5.1.13　-20 ℃冰柜。
5.1.14　2 ℃～8 ℃冰箱。
5.2　试剂
除另有规定外，所有生化试剂均为分析纯。
5.2.1　蛋白酶K（见附录A.1）。
5.2.2　10 %SDS液（见附录A.2）。
5.2.3　70%乙醇（见附录A.3）。
5.2.4　1.0%琼脂糖凝胶（见附录A.4）。
5.2.5　DNA Marker 2000。
5.2.6　超纯水：符合GB/T 6682，三级。
5.2.7　引物：
PRV-Fwd：5-CTGGCTCTGCGTGCTGTG-3；
PRV-Rev：5-GGTCCATTCGTCACTTCCG-3；
扩增片段长度348 bp。
6　操作程序
6.1　样品的采集和处理
6.1.1　样品的采集
临床上猪的脑组织、淋巴结等，置于-20 ℃冰柜或液氮中保存。
6.1.2　样品的处理
6.1.2.1　取猪的脑组织、淋巴结等约5 g于研钵中，用剪刀剪碎，加入2 mL PBS缓冲液，研磨。
6.1.2.2　阳性对照处理：含有PRV gE基因的DNA。
6.1.2.3　阴性对照处理：灭菌双蒸水。
6.2　DNA的提取
用蛋白酶K裂解法提取总DNA。
6.2.1　取研磨液500 μL于1.5 mL离心管中，加入50 μg/mL的蛋白酶K 5 μL，加入10%的SDS溶液25 μL，55 ℃水浴2 h～3 h。
6.2.2　加入200 μL Tris饱和酚，充分混匀，10000 g离心15 min。
6.2.3　取上清于一新的离心管中，加入200 μL Tris饱和酚和200 μL氯仿，10000 g离心15 min。
6.2.4　取上清于一新离心管中，加入200 μL氯仿，10000 g离心15 min。
6.2.5　取上清于一新离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，-20 ℃静置20 min，10000 g离心15 min，弃上清。
6.2.6　加入70 %的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。
6.2.7　加入100 μL灭菌双蒸水溶解沉淀，-20 ℃保存备用。
试验中同时设立含有PRV gE基因的DNA作为阳性对照和灭菌双蒸水作为阴性对照。
6.3　PCR
PCR为50 μL体系，按表1中1～7的循序配制。
PCR反应体系（50μL）
序号体系组成体系含量
1 灭菌双蒸水 37.5 μL
2 DNA 4 μL
3 10 mmol/L上游引物 0.5 μL
4 10 mmol/L下游引物 0.5 μL
5 10×PCR Buffer 5 μL
6 2.5 mmol/L dNTPs 2 μL
7 Taq酶 0.5 μL
首先加入双蒸灭菌水，然后按顺序逐一加入上述成分，每次要加入到液面下。全部加完后，混悬，瞬时离心，使液体都沉降到PCR管底。循环参数为95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，循环30次，72 ℃延伸10 min结束。
6.4　电泳
6.4.1　制备1.0 %琼脂糖凝胶板，见附录A.4。
6.4.2　取5 μL PCR产物与0.5 μL加样缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中。
6.4.3　加入分子量标准。
6.4.4　盖好电泳仪，插好电极，5 V/cm电压电泳，30 min～40 min。
6.4.5　用凝胶成像仪观察、扫描图片存档。
6.4.6　用分子量标准比较判断PCR片段大小。
7　结果判定
7.1　在阳性对照出现348 bp扩增带、阴性对照无此扩增带时，实验结果成立（参见附录A.5）。
7.2　被检样品出现348 bp扩增带判定为伪狂犬病病毒gE基因阳性，未出现相应扩增带的样品判定为伪狂犬病病毒gE基因阴性。

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